翻訳サンプル・ジカウイルスRNAワクチン(訳文全文)

こちらの記事で取り上げた明細書の訳文です。

原文は、お手数ですがこちら(pdf版)をご参照ください。テキスト版を訳文の下に貼り付けましたが、一部文字化けを含んでいる可能性があります。

★は、原文ミスに起因するコメントを付けた箇所です。[P3/L25]の表記は、原文(pdf)中のP(ページ)、L(行)を示しています。原文に印刷されているページ数・行数でカウントしています。

配列・表などは一部省略しています。

明細書詳細

  • Title:ZIKA VIRUS RNA VACCINES
  • PCT Publication No. : WO2019055807A1
  • Publication date : 2019-03-21
  • Applicant : MODERNATX,INC

【書類名】明細書
【発明の名称】ジカウイルスRNAワクチン
 【0001】
 関連出願
 本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2017年9月14日に出願された米国仮出願第62/558,746号の、米国特許法第119条(e)に基づく利益を主張するものである。
【背景技術】
 【0002】
 ジカウイルス(ZIKV)は、1947年にウガンダのジカ森でセンチネルアカゲザルから同定された。歴史的に、ZIKVはヤブカ属(Aedes)種の蚊とジャングルの非ヒト霊長類の間で循環し、アフリカおよび東南アジアの一部のヒト集団に偶発的に流入した。感染には、頭痛、発疹、結膜炎、筋肉痛および関節痛を特徴とする軽度の自然治癒性の発熱性疾患が伴った。2010年より、特に西半球の国々へのジカウイルスの拡散および伝播に関して、より深刻な臨床結果が認められた。妊娠中、とりわけ第1三半期および第2三半期中の子宮内での胎児の感染は、脳内石灰化、小頭症および流産を含む胎盤機能不全および先天奇形に関連している。成人では、ZIKV感染症は、麻痺および多発ニューロパチーを特徴とする自己免疫疾患であるギラン・バレー症候群(GBS)の発生率の上昇と関連づけられる。蚊による感染および子宮内感染に加えて、ZIKVの性行為感染が、男性から女性、男性から男性、および女性から男性で示されている。感染後最長で6ヶ月、精液、精子、および膣分泌物中にウイルスRNAが検出されていることから、持続性のZIKV感染症が生じる恐れがある。このように、ZIKVは今や、南北アメリカ、アフリカ、およびアジアにおいて、複数の経路を介した地域感染および旅行関連感染を伴う全世界的な疾患である。ZIKV感染症の出現により、安全で有効なワクチンの開発のための全世界的な取り組みが促進されている。
【発明の概要】
 【0003】
 本明細書にて提供される実験結果は、ZIKV prMEタンパク質に融合した日本脳炎ウイルス(JEV)シグナルペプチドをコードするジカウイルス(ZIKV)RNAワクチンによる、有効率の予期せぬ向上を示す。実施例に示すように、prMEに融合したJEVシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンは、意外にも、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して20倍低い用量で、非ヒト霊長類における殺菌免疫(sterilizing immunity)をもたらした。
 【0004】
 したがって、いくつかの態様では、5’UTR、ZIKV prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするORF、および3’UTRを含むRNAワクチンが、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、5’UTRは、配列番号13および配列番号14から選択される。いくつかの実施形態では、ORFは、配列番号1~6から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、3’UTRは、配列番号15および配列番号16から選択される。いくつかの実施形態では、JEVシグナルペプチドは、次の配列:MWLVSLAIVTACAGA(配列番号18)を含む。いくつかの実施形態では、JEVシグナルペプチドは、次の配列:AUGUGGCUGGUGUCCCUGGCCAUCGUGACA GCCUGUGCUGGCGCC(配列番号19)によってコードされる。
 【0005】
 ZIKV prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むRNAワクチンを、対象においてZIKV prME特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与することを含む方法であって、当該有効な量が、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して少なくとも10倍低い用量で、対象において殺菌免疫をもたらすのに十分である方法もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、有効な量は、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して少なくとも20倍低い用量で、対象において殺菌免疫をもたらすのに十分である。
 【0006】
 いくつかの態様では、方法は、ZIKV prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするORFを含むRNAワクチンを、ZIKVへの曝露3~7日後に、コントロールと比較して対象におけるウイルス量を少なくとも80%まで低減させるのに有効な量で対象に投与することを含み、当該コントロールが、JEVのシグナル配列を欠くZIKV RNAワクチンを投与された対象におけるウイルス量である、方法である。
 【0007】
 他の態様では、方法は、ZIKV prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするORFを含むRNAワクチンを、対象においてZIKV prME特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与することを含み、RNAワクチンの有効率が、ワクチン非接種のコントロール対象に対して少なくとも80%である、方法である。
【図面の簡単な説明】
 【0008】
  【図1】10μg、50μgまたは200μgのZIKV mRNAワクチンでワクチン接種した非ヒト霊長類(NHP)における、(ZIKVへの)曝露3日後、4日後、5日後、6日後および7日後のウイルス収量(log10フォーカス形成単位(FFU)/ml)を示すグラフである。ワクチン「mRNA-1325」は、ZIKV prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードする。ワクチン「mRNA-1893」は、ZIKV prMEに融合したJEVシグナルペプチドをコードする。mRNA-1325ワクチンの200μgの単回用量は、ほぼ完全な防御を与える。意外にも、mRNA-1893ワクチンは、このモデルにおいてmRNA-1325ワクチンよりも少なくとも20倍優れている。
  【図2】図1に記載されているものと同一のNHP実験より得た中和抗体価(8週目に対するEC50の倍率変化)を示すグラフを含む。
【発明を実施するための形態】
 【0009】
 ジカウイルス(ZIKV)は、フラビウイルス科ウイルスファミリーおよびフラビウイルス属のメンバーである。ヒトでは、ジカウイルスはジカ熱として知られる疾患の原因となる。ジカウイルスは、同様にフラビウイルス科ウイルスファミリーのメンバーであるウイルスの、デング熱、黄熱、ウエストナイル脳炎および日本脳炎と近縁である。ZIKVは、蚊の刺咬によって人々に拡散する。ZIKV疾患(ジカ(Zika))の最も一般的な症状は、発熱、発疹、関節痛、赤目である。この疾病は一般に軽度で、数日から1週間続く症状を伴う。ZIKVを予防するためのワクチン、または治療するための薬剤は存在しない。
 【0010】
 本明細書において、いくつかの実施形態では、5’非翻訳領域(UTR)、ZIKV prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)および3’UTRを含むZIKVリボ核酸(RNA)ワクチン(例えば、mRNAワクチン)が提供される。いくつかの実施形態では、ZIKV RNAワクチンは、ポリA尾部を含む。
 【0011】
 5’UTRは、開始コドン(リボソームによって翻訳されるmRNA転写物の最初のコドン)からすぐ上流(5’)のmRNAの領域である。5’UTRは、ポリペプチドをコードしない(ノンコーディングである)。いくつかの実施形態では、本開示の5’UTRは、配列番号13および配列番号14から選択される配列を含む。
 【0012】
 3’UTRは、終止コドン(翻訳の終結を示すmRNA転写物のコドン)からすぐ下流(3’)のmRNAの★領域である。3’UTRは、ポリペプチドをコードしない(ノンコーディングである)。いくつかの実施形態では、本開示の3’UTRは、配列番号15および配列番号16から選択される配列を含む。

[P3/L25] A 3′ UTR is region of an mRNA that is directly downstream (3′) from the stop codon (the codon of an mRNA transcript that signals a termination of translation)

文末にピリオドが抜けていますが補って訳しています。

 【0013】
 ポリA尾部は、3’UTRから下流、例えばすぐ下流の、複数の連続的なアデノシン一リン酸を含有するmRNAの領域である。関連する生物学的環境(例えば、細胞内、生体内)では、ポリA尾部は、例えば細胞質において酵素的分解からmRNAを保護するように機能し、転写終結、核からのmRNA輸送、および翻訳を補助する。ポリA尾部は、例えば、10個~300個のアデノシン一リン酸を含み得る。例えば、ポリA尾部は、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、220個、230個、240個、250個、260個、270個、280個、290個または300個のアデノシン一リン酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリA尾部は、50個~250個のアデノシン一リン酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリA尾部は、100個のアデノシン一リン酸を含む。
 【0014】
 いくつかの実施形態では、ZIKV RNAワクチンは、5’末端キャップ、例えば、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpを含む。
 【0015】
 オープンリーディングフレームは、開始コドン(例えば、メチオニン(ATGまたはAUG))で始まり、終止コドン(例えば、TAA、TAGもしくはTGA、またはUAA、UAGもしくはUGA)で終わるDNAまたはRNAの連続区間である。いくつかの実施形態では、本開示のORFは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および配列番号6から選択される。いくつかの実施形態では、ORFは、配列番号1の配列を含む。いくつかの実施形態では、ORFは、配列番号2の配列を含む。いくつかの実施形態では、ORFは、配列番号3の配列を含む。いくつかの実施形態では、ORFは、配列番号4の配列を含む。いくつかの実施形態では、ORFは、配列番号5の配列を含む。いくつかの実施形態では、ORFは、配列番号6の配列を含む。
 【0016】
 本開示のZIKV RNAワクチン(例えば、mRNAワクチン)は、ZIKV prMEタンパク質に(フレーム内で)融合したJEVシグナルペプチド(例えば、配列番号18)をコードする。特定のprME配列は、任意のZIKV株、例えば、当該技術分野において周知のZIKV株またはその他本明細書に記載の株、例えば、ブラジル株、ミクロネシア株、またはアフリカ株に由来し得る。ジカファミリー(Zika family)内では、これまでに分離された全ての株にわたって、prME配列内に高レベルの相同性(90%超)が存在する。この高度の相同性は、1947年の最初の分離株と2015年にブラジルで循環したより現代の株とを比較した場合にも保存されており、これは、最初の分離株から「ドリフト」が生じていることを示唆している。さらに、弱毒化ウイルス製剤は、ラテンアメリカ/アジア、およびアフリカの株を含む他の全ての試験した株に対して交叉免疫を与えた。全体として、このデータはprMEベースのワクチンを用いて全てのジカ株(Zika strain)の交叉防御が可能であることを示唆する。実際に、ZIKVのprM/Mタンパク質およびEタンパク質は、現在循環しているアジアウイルス株とブラジルウイルス株の間で、著しく高いレベル(99%)の配列保存性を有する。
 【0017】
 Mタンパク質およびEタンパク質は、ウイルス粒子の表面に存在する。中和抗体は主にEタンパク質に結合し、preM/Mタンパク質は、Eタンパク質の適切なフォールディングのためのシャペロンとして機能し、細胞分泌経路に沿った酸性区画内でのEタンパク質の未熟な融合を防止する。
 【0018】
 いくつかの実施形態では、ZIKV prMEタンパク質は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、および配列番号12から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ZIKV prMEタンパク質は、配列番号7の配列を含む。いくつかの実施形態では、ZIKV prMEタンパク質は、配列番号8の配列を含む。いくつかの実施形態では、ZIKV prMEタンパク質は、配列番号9の配列を含む。いくつかの実施形態では、ZIKV prMEタンパク質は、配列番号10の配列を含む。いくつかの実施形態では、ZIKV prMEタンパク質は、配列番号11の配列を含む。いくつかの実施形態では、ZIKV prMEタンパク質は、配列番号12の配列を含む。
 【0019】
 本開示のZIKV RNAワクチン(例えば、mRNAワクチン)は、prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードする。タンパク質のN末端の15~60アミノ酸を構成するシグナルペプチドは、通常、分泌経路上の膜を横切る移行に必要であり、そのため、一般に、真核生物および原核生物の両方における大部分のタンパク質の分泌経路への進入を制御する。真核生物では、新生前駆体タンパク質(プレタンパク質)のシグナルペプチドがリボソームを粗面小胞体(ER)膜へと向かわせ、プロセシングのために粗面小胞体膜を横切って伸長ペプチド鎖の輸送を開始させる。ERでのプロセシングは成熟タンパク質を産生し、その際、シグナルペプチドは、一般に宿主細胞のER常在性シグナルペプチダーゼによって前駆体タンパク質から切断されるか、または切断されずに残り、膜アンカーとして機能する。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜への標的化を容易にし得る。いくつかの実施形態では、本開示のJEVシグナルペプチドは、配列番号18の配列を含む。
 【0020】
 いくつかの実施形態では、本開示のRNAワクチンのRNA(例えば、mRNA)は、化学修飾されている。例えば、ORF中のウラシルの少なくとも80%が、N1-メチル-シュードウリジンおよびN1-エチル-シュードウリジンから選択される化学修飾を有する場合がある。いくつかの実施形態では、ORF中のウラシルの少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%が、化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、化学修飾は、ウラシルの5位に存在する。
 【0021】
 いくつかの実施形態では、本開示のZIKV RNAワクチンの少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)は化学修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシンおよびウリジンからなる標準のリボヌクレオチドを含む。
 【0022】
 本開示のZIKV RNAワクチン(例えば、mRNAワクチン)は、通常、脂質ナノ粒子中に配合される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも1つのイオン化カチオン性脂質、少なくとも1つの非カチオン性脂質、少なくとも1つのステロール、および/または少なくとも1つのポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、20~60%のモル比のイオン化カチオン性脂質、5~25%のモル比の非カチオン性脂質、25~55%のモル比のステロール、および0.5~15%のモル比のPEG修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、イオン化カチオン性脂質は以下の化合物:

を含む。
 【0023】
 本明細書にて提供されるデータは、prMEに融合したJEVシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンが、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して20倍低い用量で、非ヒト霊長類における殺菌免疫をもたらすことを示す。したがって、本明細書において、いくつかの実施形態では、ZIKV prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするORFを含むRNAワクチンを、対象においてZIKV prME特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与することを含む方法であって、当該有効な量が、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して少なくとも5倍低い用量で、対象において殺菌免疫をもたらすのに十分である方法が提供される。いくつかの実施形態では、有効な量は、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して少なくとも10倍低い用量で、対象において殺菌免疫をもたらすのに十分である。★有効な量は、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して少なくとも15倍低い用量で、対象において殺菌免疫をもたらすのに十分である。★有効な量は、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して少なくとも20倍低い用量で、対象において殺菌免疫をもたらすのに十分である。

[P6/L17,19] the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 15-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME. 

文頭が”the effective amount”と小文字で始まっていますが、前後の文から、おそらく”In some embodiments, “が抜けているのではと思われます。原文通り訳しています。

 【0024】
 対象は、非ヒト霊長類およびヒト対象を含む任意の哺乳動物であってよい。典型的には、対象はヒト対象である。
 【0025】
 いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ZIKV prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするORFを含むRNAワクチンを、(例えば、ZIKVへの曝露3~7日後に)コントロールと比較して、対象におけるウイルス量を少なくとも80%まで低減させるのに有効な量で対象に投与することを含み、当該コントロールが、JEVのシグナル配列を欠くZIKV RNAワクチンを投与された対象におけるウイルス量である、方法である。
 【0026】
 いくつかの実施形態では、投与されるZIKV RNAワクチンの量は、対象におけるウイルス量を、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%、低減させるのに有効である。いくつかの実施形態では、コントロールは、IgEのシグナル配列を含有するZIKV RNAワクチンを投与された対象におけるウイルス量である。
 【0027】
 いくつかの実施形態では、コントロールは、ワクチン非接種の対象におけるウイルス量である。いくつかの実施形態では、方法は、ZIKV prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするORFを含むZIKVワクチンを、対象においてZIKV prME特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与することを含み、RNAワクチンの有効率が、ワクチン非接種のコントロール対象に対して少なくとも60%である、方法である。例えば、ZIKV RNAワクチンの有効率は、ワクチン非接種のコントロール対象に対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも98%であり得る。いくつかの実施形態では、RNAワクチンの有効率は、ワクチン非接種のコントロール対象に対して少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、RNAワクチンの有効率は、ワクチン非接種のコントロール対象に対して少なくとも95%である。
 【0028】
 ワクチン有効率は、標準的な分析法を用いて評価することができる(例えば、Weinberg et al.,J Infect Dis.2010 Jun 1;201(11):1607-10を参照のこと)。例えば、ワクチン有効率は、二重盲検ランダム化対照臨床試験によって測定することができる。ワクチン有効率は、ワクチン非接種(ARU)試験コホートとワクチン接種(ARV)試験コホート間の疾患罹患率(AR)の比例的低下として示すことができ、次の式:有効率=(ARU-ARV)/ARU×100、および有効率=(1-RR)×100を使用して、ワクチン接種群間の疾患の相対危険(RR)から算出することができる。
 【0029】
 同様に、ワクチン有効性は、標準的な分析法を用いて評価することができる(例えば、Weinberg et al.,J Infect Dis.2010 Jun 1;201(11):1607-10を参照のこと)。ワクチン有効性は、(高いワクチン有効率を有すると既に証明されている可能性のある)ワクチンが、母集団においていかに疾患を減少させるかを評価するものである。この基準は、対照臨床試験内ではなく自然なフィールド条件下で、ワクチン自体のみならず、ワクチンプログラムの利益と悪影響の正味のバランスを評価することができる。ワクチン有効性は、ワクチン有効率(効力)に比例するが、母集団中の標的集団がいかに良好に免疫されたかによって、加えて、入院、外来受診またはコストの「実際の」結果に影響を与える他の非ワクチン関連因子によっても影響される。例えば、後ろ向き症例対照分析を使用することができ、この分析では、ワクチン接種率を、一組の感染症例と適切なコントロールとの間で比較する。ワクチン有効性は、ワクチン接種にもかかわらず感染症に罹患するオッズ比(OR)を用いて、率差として示すことができる(有効性=(1-OR)×100)。
 【0030】
 いくつかの実施形態では、有効な量のZIKV RNAワクチンは、投与後1~72時間における対象の血清中で測定した場合に検出可能なレベルのZIKV prMEタンパク質を産生するのに十分である。
 【0031】
 いくつかの実施形態では、有効な量のZIKV RNAワクチン量は、投与後1~72時間における対象の血清中で測定した場合に、ZIKV prMEタンパク質に対する中和抗体によって生じる1,000~10,000の中和力価を生じさせるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効な量のZIKV RNAワクチン量は、投与後1~72時間における対象の血清中で測定した場合に、ZIKV prMEタンパク質に対する中和抗体によって生じる1,000~5,000の中和力価を生じさせるのに十分である。いくつかの実施形態では、有効な量のZIKV RNAワクチン量は、投与後1~72時間における対象の血清中で測定した場合に、ZIKV prMEタンパク質に対する中和抗体によって生じる5,000~10,000の中和力価を生じさせるのに十分である。
 【0032】
 いくつかの実施形態では、ZIKV RNAワクチンを投与された対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価は、コントロールと比較して少なくとも1log上昇し、当該コントロールは、ZIKVに対するワクチンを投与されていない対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価である。いくつかの実施形態では、ZIKV RNAワクチンを投与された対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価は、コントロールと比較して少なくとも2log上昇する。いくつかの実施形態では、ZIKV RNAワクチンを投与された対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価は、コントロールと比較して少なくとも5log上昇する。いくつかの実施形態では、ZIKV RNAワクチンを投与された対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価は、コントロールと比較して少なくとも10log上昇する。
 【0033】
 いくつかの実施形態では、対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価は、コントロールと比較して少なくとも2倍上昇し、当該コントロールは、ZIKVに対するワクチンを投与されていない対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価である。いくつかの実施形態では、対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価は、コントロールと比較して少なくとも5倍上昇する。いくつかの実施形態では、対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価は、コントロールと比較して少なくとも10倍上昇する。
 【0034】
 本明細書にて提供される有効な量のZIKV RNAワクチン(例えば、mRNAワクチン)は、驚くべきことに、わずか20μgで、例えば、単回用量としてまたは2回の10μg用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、有効な量は、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μgまたは200μgである。いくつかの実施形態では、有効な量は、25μg~200μgの総用量である。
 【0035】
 以下の表1は、ワクチンによってコードされるZIKV mRNAワクチンの配列および対応するタンパク質の配列の例を示す。
 【0036】
 表1 ZIKV mRNAワクチンの配列
<表1省略>
 【0037】
 表1に示すオープンリーディングフレーム(ORF)のいずれも、次の5’UTR配列または他の5’UTR配列(例えば、野生型5’UTR配列)のいずれかを含み得る:GGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACC(配列番号13)。GGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号14)。
 【0038】
 同様に、表1に示すORFのいずれも、次の3’UTR配列または他の3’UTR配列(例えば、野生型3’UTR配列)のいずれかを含み得る:GAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCC CCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAA AGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号15)。GAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCC CCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAA AGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号16)。
 【0039】
 さらに、表1に示すORFのいずれも、ポリA尾部(例えば、100ヌクレオチド)を含み得る。
 【0040】
 いくつかの実施形態では、ZIKV mRNAワクチン(mRNA-1893)は、5’UTR、3’UTRおよびポリA尾部を含む以下の配列を含む:<配列省略>。
【実施例】
 【0041】
 非ヒト霊長類(n=5)を、ZIKV prME抗原に融合したIgEシグナルペプチド(mRNA-1325、★(1)配列番号X)(200μgの単回用量、または10μg、50μgもしくは200μgの用量、次いで4週目に等量の追加免疫★(2))あるいはZIKV prME抗原に融合したJEVシグナルペプチド(mRNA-1893、★(1)配列番号X)(10μg、次いで4週目に等量の追加免疫)のいずれかをコードするmRNAを含むワクチン組成物で筋肉内(IM)に免疫した。8週目に1000フォーカス形成単位(FFU)のジカウイルスに動物を曝露させた。曝露3日後、4日後、5日後、6日後および7日後に血清を回収した。図1のデータは、mRNA-1325ワクチンの200μgの単回用量はほぼ完全な防御を与える一方で、mRNA-1893ワクチンは、意外にも20倍低い用量で殺菌免疫をもたらすことを示す。中和抗体価(8週目に対するEC50の倍率変化)を図2に示す。<配列省略>

(1)[P17/L49, P18/L1] mRNA- 1325, SEQ ID NO:X ,  mRNA-1893, SEQ ID NO:X

SEQ ID NO:Xは明細書中に見当たらず、おそらく具体的な数字が入るものと思われます。原文通り記載しています。

(2)[P17/L50] (a single 200 μg dose, or a 10 μg, 50 μg or 200 μg dose followed by an equivalent boost at week 4, or a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME antigen (mRNA-1893, SEQ ID NO:X) 

boost at week 4,は、boost at week 4),が正であると思われます。括弧を補って訳しています。

 

 【0042】
 本明細書に開示される全ての参照文献、特許および特許出願は、各々の引用された対象に関して参照により組み込まれ、場合によっては、その文書全体が包含され得る。
 【0043】
 本明細書および本特許請求の範囲において使用する場合、不定冠詞「a」および「an」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
 【0044】
 2つ以上の工程または処置を含む本明細書で特許請求されるいかなる方法において、明確に反対の指示がない限り、方法の工程または処置の順序は、詳述された方法の工程または処置の順序に必ずしも限定されないこともまた理解されるべきである。
 【0045】
 特許請求の範囲、および上述の明細書において、全ての移行句、例えば、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「備える(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「含む(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」などは、非制限、すなわち、それらを含むが限定されないと理解されるべきである。米国特許局特許審査便覧(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures)のセクション2111.03に記載されているように、移行句「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」のみが、それぞれ制限移行句または半制限移行句である。

【書類名】特許請求の範囲
【請求項1】
 ジカウイルス(ZIKV)prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むリボ核酸(RNA)ワクチンを、対象においてZIKV prME特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で前記対象に投与することを含む方法であって、
 前記有効な量が、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して少なくとも10倍低い用量で、前記対象において殺菌免疫(sterilizing immunity)をもたらすのに十分である、方法。
【請求項2】
 ジカウイルス(ZIKV)prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むリボ核酸(RNA)ワクチンを、ZIKVへの曝露3~7日後に、コントロールと比較して対象におけるウイルス量を少なくとも80%まで低減させるのに有効な量で前記対象に投与することを含む方法であって、
 前記コントロールが、前記JEVのシグナル配列を欠くZIKV RNAワクチンを投与された対象におけるウイルス量である、方法。
【請求項3】
 ジカウイルス(ZIKV)prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むリボ核酸(RNA)ワクチンを、対象においてZIKV prME特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で前記対象に投与することを含む方法であって、
 前記RNAワクチンの有効率が、ワクチン非接種のコントロール対象に対して少なくとも80%である、方法。
【請求項4】
 前記有効な量が、prMEに融合したIgEシグナルペプチドをコードするZIKV mRNAワクチンと比較して少なくとも20倍低い用量で、前記対象において殺菌免疫をもたらすのに十分である、請求項3に記載の方法。
【請求項5】
 前記有効な量が、投与後1~72時間における前記対象の血清中で測定した場合に検出可能なレベルのZIKV prMEタンパク質を産生するのに十分である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項6】
 前記有効な量が、投与後1~72時間における前記対象の血清中で測定した場合に、前記ZIKV prMEタンパク質に対する中和抗体によって生じる1,000~10,000の中和力価を生じさせるのに十分である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
 前記対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価が、コントロールと比較して少なくとも1log上昇し、前記コントロールが、ZIKVに対するワクチンを投与されていない対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
 前記対象において生じる前記抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価が、コントロールと比較して少なくとも2倍上昇し、前記コントロールが、ZIKVに対するワクチンを投与されていない対象において生じる抗ZIKV prMEタンパク質の抗体力価である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項9】
 前記有効な量が、20μg~200μgの総用量である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項10】
 前記RNAワクチンが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項11】
 前記RNAワクチンが、修飾ヌクレオチドを含まない、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項12】
 前記ORF中のウラシルヌクレオチドの少なくとも80%が、N1-メチル-シュードウリジンまたはN1-エチル-シュードウリジンから選択される化学修飾を有する、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項13】
 前記RNAワクチンが、配列番号13および配列番号14から選択される配列を含む5’非翻訳領域(UTR)をさらに含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項14】
 前記RNAワクチンが、配列番号15および配列番号16から選択される配列を含む3’UTRをさらに含む、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項15】
 前記ORFが、配列番号1~6から選択される配列を含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項16】
 前記ZIKV prMEタンパク質が、配列番号7~12から選択される配列を含む、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項17】
 前記JEVシグナルペプチドが、配列番号18の配列を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項18】
 前記RNAワクチンが、脂質ナノ粒子中に配合される、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項19】
 前記脂質ナノ粒子が、20~60%のモル比のイオン化カチオン性脂質、5~25%のモル比の非カチオン性脂質、25~55%のモル比のステロール、および0.5~15%のモル比のPEG修飾脂質を含む、請求項18に記載の方法。

P22 Claim19

文末にピリオドが抜けていますが補って訳しています。

【請求項20】
 前記イオン化カチオン性脂質が、以下の化合物:


を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項21】
 前記RNAワクチンが、メッセンジャーRNA(mRNA)ワクチンである、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項22】
 前記ワクチンが、配列番号20の配列または配列番号20の配列と少なくとも95%同一である配列を含む、請求項1~21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項23】
 5’非翻訳領域(UTR)、ジカウイルス(ZIKV)prMEタンパク質に融合したJEVシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)および3’UTRを含む、リボ核酸(RNA)ワクチン。
【請求項24】
 前記5’UTRが、配列番号13および配列番号14から選択される配列を含む、請求項23に記載のRNAワクチン。
【請求項25】
 前記ORFが、配列番号1~6から選択される配列を含む、請求項23または24に記載のRNAワクチン。

P23 Claim25

文末にピリオドが抜けていますが補って訳しています。

【請求項26】
 前記3’UTRが、配列番号15および配列番号16から選択される配列を含む、請求項23~25のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項27】
 前記ZIKV prMEタンパク質が、配列番号7~12から選択される配列を含む、請求項23~26のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項28】
 前記JEVシグナルペプチドが、配列番号18の配列を含む、請求項23~27のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項29】
 前記RNAワクチンが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項23~28のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項30】
 前記RNAワクチンが、修飾ヌクレオチドを含まない、請求項23~28のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項31】
 前記ORF中のウラシルの少なくとも80%が、N1-メチル-シュードウリジンまたはN1-エチル-シュードウリジンから選択される化学修飾を有し、任意で、前記化学修飾がウラシルの5位に存在する、請求項23~30のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項32】
 前記RNAワクチンが、脂質ナノ粒子中に配合される、請求項23~31のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項33】
 前記脂質ナノ粒子が、20~60%のモル比のイオン化カチオン性脂質、5~25%のモル比の非カチオン性脂質、25~55%のモル比のステロール、および0.5~15%のモル比のPEG修飾脂質を含む、請求項32に記載のRNAワクチン。

P23 Claim33

文末にピリオドが抜けていますが補って訳しています。

【請求項34】
 前記イオン化カチオン性脂質が、以下の化合物:


を含む、請求項33に記載のRNAワクチン。
【請求項35】
 前記RNAワクチンが、メッセンジャーRNA(mRNA)ワクチンである、請求項23~34のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項36】
 配列番号20の配列と少なくとも95%同一である配列を含む、請求項23~25のいずれか1項に記載のRNAワクチン。
【請求項37】
 前記配列が、配列番号20の配列と少なくとも98%同一である、請求項36に記載のRNAワクチン。
【請求項38】
 前記配列が、配列番号20を含む、請求項37に記載のRNAワクチン。

【書類名】要約書
【要約】ジカウイルスprMEタンパク質に融合した日本脳炎ウイルス(JEV)シグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むジカウイルスRNAワクチン、および対象において抗原特異的免疫応答を生じさせる方法が、本明細書で提供される。
【選択図】図1

原文(表などを一部省略しています)

ZIKA VIRUS RNA VACCINES
RELATED APPLICATION
This application claims the benefit under 35 U.S.C. § 119(e) of U.S. provisional application number 62/558,746, filed September 14, 2017, which is incorporated by reference herein in its entirety.
BACKGROUND
Zika virus (ZIKV) was identified in 1947 from a sentinel Rhesus monkey in the Zika Forest of Uganda. Historically, ZIKV circulated between Aedes species mosquitoes, non- human primates in the jungle, and episodically spilled into human populations in Africa and parts of Southeast Asia. Infection was associated with a mild, self-limiting febrile illness characterized by headache, rash, conjunctivitis, myalgia, and arthralgia. Since 2010, and especially in the context of its spread and dissemination to countries of the Western
Hemisphere, more severe clinical consequences have been observed. Infection of fetuses in utero during pregnancy, particularly during the first and second trimesters, has been associated with placental insufficiency and congenital malformations including cerebral calcifications, microcephaly, and miscarriage. In adults, ZIKV infection is linked to an increased incidence of Guillain-Barre syndrome (GBS), an autoimmune disease characterized by paralysis and polyneuropathy. In addition to mosquito and in utero transmission, sexual transmission of ZIKV has been described from men-to-women, men-to-men, and women-to- men. Persistent ZIKV infection can occur, as viral RNA has been detected in semen, sperm, and vaginal secretions up to 6 months following infection. Thus, ZIKV is now a global disease with locally-acquired and travel-associated transmission through multiple routes in the Americas, Africa, and Asia. The emergence of ZIKV infection has prompted a global effort to develop safe and effective vaccines.
SUMMARY
Experimental results provided herein demonstrate an unexpected improvement in efficacy with Zika virus (ZIKV) RNA vaccines encoding a Japanese encephalitis virus (JEV) signal peptide fused to a ZIKV prME protein. As shown in the Examples, the ZIKV mRNA vaccine encoding a JEV signal peptide fused to prME unexpectedly provided sterilizing immunity in non-human primates at a 20-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME.
Thus, in some aspects, provided herein are RNA vaccines that comprise a 5′ UTR, an ORF encoding a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME protein, and a 3′ UTR. In some embodiments, the 5′ UTR is selected from SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the ORF comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: l-6. In some embodiments, the 3′ UTR is selected from SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the JEV signal peptide comprises the following sequence:
MWLVSLAIVTACAGA (SEQ ID NO: 18). In some embodiments, the JEV signal peptide is encoded by the following sequence: AUGUGGCUGGUGUCCCUGGCCAUCGUGACA GCCUGUGCUGGCGCC (SEQ ID NO: 19).
Also provided herein are methods comprising administering to a subject a RNA vaccine comprising an open reading frame (ORF) encoding a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME protein in an effective amount to induce in the subject a ZIKV prME- specific immune response, wherein the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 10-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME. In some embodiments, the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 20-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME.
In some aspects, the methods comprise administering to a subject a RNA vaccine comprising an ORF encoding a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME protein in an effective amount to reduce viral load in the subject by at least 80%, relative to a control, at 3- 7 days following exposure to ZIKV, wherein the control is the viral load in a subject administered a ZIKV RNA vaccine lacking the JEV signal sequence.
In other aspects, the methods comprise administering to a subject a RNA vaccine comprising an ORF encoding a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME protein in an effective amount to induce in the subject a ZIKV prME-specific immune response, wherein efficacy of the RNA vaccine is at least 80% relative to unvaccinated control subjects. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
FIG. 1 is a graph showing the viral yield (logio focus forming units (FFU)/ml) 3, 4, 5, 6 and 7 days post challenge (with ZIKV) in non-human primates (NHPs) vaccinated with 10 μg, 50 μg, or 200 μg ZIKV mRNA vaccine. Vaccine ‘mRNA- 1325’ encodes an IgE signal peptide fused to ZIKV prME. Vaccine ‘mRNA-1893’ encodes a JEV signal peptide fused to ZIKV prME. A single 200 μg dose of the mRNA-1325 vaccine confers nearly complete protection. Unexpectedly, the mRNA-1893 vaccine outperforms the mRNA-1325 vaccine in this model by at least 20x.
FIG. 2 includes graphs showing neutralizing antibody titers (EC50 fold change relative to week 8) obtained from the same NHP experiments described in FIG. 1.
DETAILED DESCRIPTION
Zika virus (ZIKV) is a member of the Flaviviridae virus family and the flavivirus genus. In humans, it causes a disease known as Zika fever. It is related to dengue, yellow fever, West Nile and Japanese encephalitis, viruses that are also members of the virus family Flaviviridae. ZIKV is spread to people through mosquito bites. The most common symptoms of ZIKV disease (Zika) are fever, rash, joint pain, and red eye. The illness is usually mild with symptoms lasting from several days to a week. There is no vaccine to prevent, or medicine to treat ZIKV.
Provided herein, in some embodiments, are ZIKV ribonucleic acid (RNA) vaccines (e.g., mRNA vaccines) comprising a 5′ untranslated region (UTR), an open reading frame (ORF) encoding a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME protein, and a 3′ UTR. In some embodiments, the ZIKV RNA vaccines comprise a polyA tail.
A 5′ UTR is region of an mRNA that is directly upstream (5′) from the start codon
(the first codon of an mRNA transcript translated by a ribosome). A 5′ UTR does not encode a polypeptide (is non-coding). In some embodiments, a 5′ UTR of the present disclosure comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
A 3′ UTR is region of an mRNA that is directly downstream (3′) from the stop codon (the codon of an mRNA transcript that signals a termination of translation) A 3′ UTR does not encode a polypeptide (is non-coding). In some embodiments, a 3′ UTR of the present disclosure comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
A polyA tail is a region of mRNA that is downstream, e.g., directly downstream, from the 3′ UTR and contains multiple, consecutive adenosine monophosphates. In a relevant biological setting (e.g., in cells, in vivo), the polyA tail functions to protect mRNA from enzymatic degradation, e.g., in the cytoplasm, and aids in transcription termination, export of the mRNA from the nucleus, and translation. A polyA tail may comprise, for example, 10 to 300 adenosine monophosphates. For example, a polyA tail may comprise 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 or 300 adenosine monophosphates. In some embodiments, a polyA tail comprises 50 to 250 adenosine monophosphates. In some embodiments, a polyA tail comprises 100 adenosine monophosphates.
In some embodiments, the ZIKV RNA vaccine comprises 5′ terminal cap, for example, 7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp.
An open reading frame is a continuous stretch of DNA or RNA beginning with a start codon (e.g., methionine (ATG or AUG)) and ending with a stop codon (e.g., TAA, TAG or TGA, or UAA, UAG or UGA). In some embodiments, an ORF of the present disclosure is selected from SEQ ID NO: l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, and SEQ ID NO:6. In some embodiments, the ORF comprises the sequence of SEQ ID NO: l. In some embodiments, the ORF comprises the sequence of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the ORF comprises the sequence of SEQ ID NO:3. In some embodiments, the ORF comprises the sequence of SEQ ID NO:4. In some embodiments, the ORF comprises the sequence of SEQ ID NO:5. In some embodiments, the ORF comprises the sequence of SEQ ID NO:6.
The ZIKV RNA vaccines (e.g., mRNA vaccines) of the present disclosure encode a JEV signal peptide (e.g., SEQ ID NO: 18) fused (in frame) to a ZIKV prME protein. The particular prME sequence may be from any ZIKV strain, for example those strains as are known in the art or as otherwise described herein, such as a Brazilian strain, a Micronesian strain, or an African strain. Within the Zika family, there is a high level of homology within the prME sequence (>90%) across all strains so far isolated. The high degree of homology is also preserved when comparing the original isolates from 1947 to the more contemporary strains circulating in Brazil in 2015, suggesting that there is “drift” occurring from the original isolates. Furthermore, attenuated virus preparations have provided cross- immunization to all other strains tested, including Latin American/Asian, and African.
Overall, this data suggests that cross-protection of all Zika strains is possible with a vaccine based on prME. In fact, the prM/M and E proteins of ZIKV have a very high level (99%) of sequence conservation between the currently circulating Asiatic and Brazilian viral strains.
The M and E proteins are on the surface of the viral particle. Neutralizing antibodies predominantly bind to the E protein, the preM/M protein functions as a chaperone for proper folding of E protein and prevent premature fusion of E protein within acidic compartments along the cellular secretory pathway. In some embodiments, the ZIKV prME protein comprises a sequence selected from SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the ZIKV prME protein comprises the sequence of SEQ ID NO:7. In some embodiments, the ZIKV prME protein comprises the sequence of SEQ ID NO:8. In some embodiments, the ZIKV prME protein comprises the sequence of SEQ ID NO:9. In some embodiments, the ZIKV prME protein comprises the sequence of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the ZIKV prME protein comprises the sequence of SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the ZIKV prME protein comprises the sequence of SEQ ID NO: 12.
ZIKV RNA vaccines (e.g., mRNA vaccines) of the present disclosure encode a JEV signal peptide fused to a prME protein. Signal peptides, comprising the N-terminal 15-60 amino acids of proteins, are typically needed for the translocation across the membrane on the secretory pathway and, thus, universally control the entry of most proteins both in eukaryotes and prokaryotes to the secretory pathway. In eukaryotes, the signal peptide of a nascent precursor protein (pre-protein) directs the ribosome to the rough endoplasmic reticulum (ER) membrane and initiates the transport of the growing peptide chain across it for processing. ER processing produces mature proteins, wherein the signal peptide is cleaved from precursor proteins, typically by a ER-resident signal peptidase of the host cell, or they remain uncleaved and function as a membrane anchor. A signal peptide may also facilitate the targeting of the protein to the cell membrane. In some embodiments, the JEV signal peptide of the present disclosure comprises the sequence of SEQ ID NO: 18.
In some embodiments, a RNA (e.g., mRNA) of a ZIKV RNA vaccine of the present disclosure is chemically modified. For example, at least 80% of the uracil in the ORF may have a chemical modification selected from N1-methyl-pseudouridine and N1-ethyl- pseudouridine. In some embodiments, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100% of the uracil in the ORF have a chemical modification. In some embodiments, the chemical modification is in the 5-position of the uracil.
In some embodiments, at least one RNA (e.g., mRNA) of the ZIKV RNA vaccines of the present disclosure are not chemically modified, and comprise the standard ribonucleotides consisting of adenosine, guanosine, cytosine and uridine.
ZIKV RNA vaccines (e.g., mRNA vaccines) of the present disclosure are typically formulated in lipid nanoparticle. In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises at least one ionizable cationic lipid , at least one non-cationic lipid, at least one sterol, and/or at least one polyethylene glycol (PEG)-modified lipid. In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 20-60% ionizable cationic lipid, 5-25% non-cationic lipid, 25-55% sterol, and 0.5-15% PEG-modified lipid. In some embodiments, the ionizable cationic lipid comprises the following compound:
Data provided herein demonstrates that ZIKV mRNA vaccines encoding a JEV signal peptide fused to prME provide sterilizing immunity in non-human primates at a 20-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME. Thus, provided herein, in some embodiments, are methods comprising administering to a subject a RNA vaccine comprising an ORF encoding a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME protein in an effective amount to induce in the subject a ZIKV prME-specific immune response, wherein the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 5-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME. In some embodiments, the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 10-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME. the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 15-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME. the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 20- fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME.
A subject may be any mammal, including non-human primate and human subjects. Typically, a subject is a human subject.
In some embodiments, methods of the present disclosure comprise administering to a subject a RNA vaccine comprising an ORF encoding a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME protein in an effective amount to reduce viral load in the subject by at least 80%, relative to a control (e.g., at 3-7 days following exposure to ZIKV), wherein the control is the viral load in a subject administered a ZIKV RNA vaccine lacking the JEV signal sequence. In some embodiments, the amount of ZIKV RNA vaccine administered is effective to reduce viral load in the subject by at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or 100%. In some embodiments, the control is the viral load in a subject administered a ZIKV RNA vaccine containing an IgE signal sequence. In some embodiments, the control is the viral load in an unvaccinated subject.
In some embodiments, the methods comprise administering to a subject ZIKV vaccine comprising an ORF encoding a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME protein in an effective amount to induce in the subject a ZIKV prME-specific immune response, wherein efficacy of the RNA vaccine is at least 60% relative to unvaccinated control subjects. For example, the efficacy of the ZIKV RNA vaccine may be at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 98%, relative to unvaccinated control subjects. In some embodiments, the efficacy of the RNA vaccine is at least 80% relative to unvaccinated control subjects. In some embodiments, the efficacy of the RNA vaccine is at least 95% relative to unvaccinated control subjects.
Vaccine efficacy may be assessed using standard analyses (see, e.g., Weinberg et al., J Infect Dis. 2010 Jun 1 ;201(11): 1607-10). For example, vaccine efficacy may be measured by double-blind, randomized, clinical controlled trials. Vaccine efficacy may be expressed as a proportionate reduction in disease attack rate (AR) between the unvaccinated (ARU) and vaccinated (ARV) study cohorts and can be calculated from the relative risk (RR) of disease among the vaccinated group with use of the following formulas:
Efficacy = (ARU – ARV)/ARU x 100; and
Efficacy = (1-RR) x 100.
Likewise, vaccine effectiveness may be assessed using standard analyses (see, e.g., Weinberg et al., J Infect Dis. 2010 Jun 1 ;201(11): 1607-10). Vaccine effectiveness is an assessment of how a vaccine (which may have already proven to have high vaccine efficacy) reduces disease in a population. This measure can assess the net balance of benefits and adverse effects of a vaccination program, not just the vaccine itself, under natural field conditions rather than in a controlled clinical trial. Vaccine effectiveness is proportional to vaccine efficacy (potency) but is also affected by how well target groups in the population are immunized, as well as by other non-vaccine-related factors that influence the ‘real- world’ outcomes of hospitalizations, ambulatory visits, or costs. For example, a retrospective case control analysis may be used, in which the rates of vaccination among a set of infected cases and appropriate controls are compared. Vaccine effectiveness may be expressed as a rate difference, with use of the odds ratio (OR) for developing infection despite vaccination: Effectiveness = (1 – OR) x 100.
In some embodiments, the effective amount of a ZIKV RNA vaccine is sufficient to produce detectable levels of ZIKV prME protein as measured in serum of the subject at 1-72 hours post administration.
In some embodiments, the effective amount of a ZIKV RNA vaccine amount is sufficient to produce a 1,000-10,000 neutralization titer produced by neutralizing antibody against the ZIKV prME protein as measured in serum of the subject at 1-72 hours post administration. In some embodiments, the effective amount of a ZIKV RNA vaccine amount is sufficient to produce a 1,000-5,000 neutralization titer produced by neutralizing antibody against the ZIKV prME protein as measured in serum of the subject at 1-72 hours post administration. In some embodiments, the effective amount of a ZIKV RNA vaccine amount is sufficient to produce a 5,000-10,000 neutralization titer produced by neutralizing antibody against the ZIKV prME protein as measured in serum of the subject at 1-72 hours post administration.
In some embodiments, an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject administered a ZIKV RNA vaccine is increased by at least 1 log relative to a control, wherein the control is an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject who has not been administered a vaccine against ZIKV. In some embodiments, an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject administered a ZIKV RNA vaccine is increased by at least 2 log relative to the control. In some embodiments, an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject administered a ZIKV RNA vaccine is increased by at least 5 log relative to the control. In some embodiments, an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject administered a ZIKV RNA vaccine is increased by at least 10 log relative to the control.
In some embodiments, an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject is increased at least 2 times relative to a control, wherein the control is an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject who has not been administered a vaccine against ZIKV. In some embodiments, an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject is increased at least 5 times relative to a control. In some embodiments, an anti- ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject is increased at least 10 times relative to a control.
The effective amount of a ZIKV RNA vaccine (e.g., mRNA vaccine), as provided herein, surprisingly may be as low as 20 μg, administered for example as a single dose or as two 10 μg doses. In some embodiments, the effective amount is 20 μg, 25 μg, 30 μg, 35 μg, 40 μg , 45 μg , 50 μg , 55 μg , 60 μg , 65 μg , 70 μg , 75 μg , 80 μg , 85 μg , 90 μg , 95 μg , 100 μg , 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg, 150 μg, 160 μg, 170 μg, 180 μg, 190 μg or 200 μg. In some embodiments, the effective amount is a total dose of 25 μg-200 μg.
Table 1 below provides examples of ZIKV mRNA vaccine sequences and corresponding protein sequences encoded by the vaccines.
Table 1 ZIKV mRNA Vaccine Sequences
Any of the open reading frames (ORFs) provided in Table 1 may include any of the following 5′ UTR sequences or other 5′ UTR sequence (e.g., wild-type 5′ UTR sequence):
• GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCG CCGCCACC (SEQ ID NO:13)
• GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC (SEQ ID NO: 14). Likewise, any of the ORFs provided in Table 1 may include any of the following 3′
UTR sequences or other 3′ UTR sequence (e.g., wild-type 3′ UTR sequence):
• UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCC CCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAA AGUCUGAGUGGGCGGC (SEQ ID NO: 15)
• UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCC CCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAA AGUCUGAGUGGGCGGC (SEQ ID NO: 16)
Further, any of the ORFs provided in Table 1 may include a polyA tail (e.g., 100 nucleotides). In some embodiments, a ZIKV mRNA vaccine (mRNA-1893) comprises the following sequence, including a 5′ UTR, 3′ UTR and polyA tail:
EXAMPLES
Non-human primates (n=5) were immunized intramuscularly (IM) with a vaccine composition comprising mRNA encoding either an IgE signal peptide fused to a ZIKV prME antigen (mRNA- 1325, SEQ ID NO:X) (a single 200 μg dose, or a 10 μg, 50 μg or 200 μg dose followed by an equivalent boost at week 4, or a JEV signal peptide fused to a ZIKV prME antigen (mRNA-1893, SEQ ID NO:X) (a 10 μg followed by an equivalent boost at week 4). Animals were challenged at week 8 with 1000 focus-forming units (FFU) of Zika virus. Serum was collected 3, 4, 5, 6 and 7 days post challenge. The data in FIG. 1 shows that while a single 200 μg dose of the mRNA-1325 vaccine conferred nearly complete protection, the mRNA-1893 vaccine unexpectedly provided sterilizing immunity at a 20 fold lower dose. Neutralizing antibody titers (EC50 fold change relative to week 8) are shown in FIG. 2.
All references, patents and patent applications disclosed herein are incorporated by reference with respect to the subject matter for which each is cited, which in some cases may encompass the entirety of the document.
The indefinite articles “a” and “an,” as used herein in the specification and in the claims, unless clearly indicated to the contrary, should be understood to mean “at least one.”
It should also be understood that, unless clearly indicated to the contrary, in any methods claimed herein that include more than one step or act, the order of the steps or acts of the method is not necessarily limited to the order in which the steps or acts of the method are recited.
In the claims, as well as in the specification above, all transitional phrases such as “comprising,” “including,” “carrying,” “having,” “containing,” “involving,” “holding,” “composed of,” and the like are to be understood to be open-ended, i.e., to mean including but not limited to. Only the transitional phrases “consisting of and “consisting essentially of shall be closed or semi-closed transitional phrases, respectively, as set forth in the United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03.
CLAIMS
What is claimed is:
1. A method comprising administering to a subject a ribonucleic acid (RNA) vaccine comprising an open reading frame (ORF) encoding a JEV signal peptide fused to a Zika virus (ZIKV) prME protein in an effective amount to induce in the subject a ZIKV prME- specific immune response, wherein the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 10-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME.
2. A method comprising administering to a subject a ribonucleic acid (RNA) vaccine comprising an open reading frame (ORF) encoding a JEV signal peptide fused to a Zika virus (ZIKV) prME protein in an effective amount to reduce viral load in the subject by at least 80%, relative to a control, at 3-7 days following exposure to ZIKV, wherein the control is the viral load in a subject administered a ZIKV RNA vaccine lacking the JEV signal sequence.
3. A method comprising administering to a subject a ribonucleic acid (RNA)vaccine comprising an open reading frame (ORF) encoding a JEV signal peptide fused to a Zika virus (ZIKV) prME protein in an effective amount to induce in the subject a ZIKV prME-specific immune response, wherein efficacy of the RNA vaccine is at least 80% relative to
unvaccinated control subjects.
4. The method of claim 3, wherein the effective amount is sufficient to provide sterilizing immunity in the subject at an at least 20-fold lower dose relative to a ZIKV mRNA vaccine encoding a IgE signal peptide fused to prME.
5. The method of any one of claims 1-4, wherein the effective amount is sufficient to produce detectable levels of ZIKV prME protein as measured in serum of the subject at 1-72 hours post administration. 6. The method of any one of claims 1-5, wherein the effective amount is sufficient to produce a 1,000-10,000 neutralization titer produced by neutralizing antibody against the ZIKV prME protein as measured in serum of the subject at 1-72 hours post administration.
7. The method of any one of claims 1-6, wherein an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in the subject is increased by at least 1 log relative to a control, wherein the control is an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject who has not been administered a vaccine against ZIKV.
8. The method of any one of claims 1-7, wherein the anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in the subject is increased at least 2 times relative to a control, wherein the control is an anti-ZIKV prME protein antibody titer produced in a subject who has not been administered a vaccine against ZIKV.
9. The method of any one of claims 1-8, wherein the effective amount is a total dose of 20 μ β-200 μg.
10. The method of any one of claims 1-9, wherein the RNA vaccine comprises at least one modified nucleotide.
11. The method of any one of claims 1-9, wherein the RNA vaccine does not comprise modified nucleotides. 12. The method of any one of claims 1-11, wherein at least 80% of uracil nucleotides in the ORF have a chemical modification selected from N1-methyl-pseudouridine or N1-ethyl- pseudouridine.
13. The method of any one of claims 1-12, wherein the RNA vaccine further comprises a 5′ untranslated region (UTR) comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 13 and SEQ
ID NO: 14.
14. The method of any one of claims 1-13, wherein the RNA vaccine further comprises a 3′ UTR comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
15. The method of any one of claims 1-14, wherein the ORF comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: 1-6.
16. The method of any one of claims 1-15, wherein the ZIKV prME protein comprises a sequence selected from SEQ ID NOs:7-12.
17. The method of any one of claims 1-16, wherein the JEV signal peptide comprises the sequence of SEQ ID NO: 18.
18. The method of any one of claims 1-17, wherein the RNA vaccine is formulated in a lipid nanoparticle. 19. The method of claim 18, wherein the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 20- 60% ionizable cationic lipid, 5-25% non-cationic lipid, 25-55% sterol, and 0.5-15% PEG- modified lipid
20. The method of claim 19, wherein the ionizable cationic lipid comprises the following compound:
21. The method of any one of claims 1-20, wherein the RNA vaccine is a messenger RNA (mRNA) vaccine.
22. The method of any one of claims 1-21, wherein the vaccine comprises the sequence of SEQ ID NO:20 or an sequence that is at least 95% identical to the sequence of SEQ ID
NO:20.
23. A ribonucleic acid (RNA) vaccine comprising a 5′ untranslated region (UTR), an open reading frame (ORF) encoding a JEV signal peptide fused to a Zika virus (ZIKV) prME protein, and a 3′ UTR.
24. The RNA vaccine of claim 23, wherein the 5′ UTR comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
25. The RNA vaccine of claim 23 or 24, wherein the ORF comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: l-6 26. The RNA vaccine of any one of claims 23-25, wherein the 3′ UTR comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
27. The RNA vaccine of any one of claims 23-26, wherein the ZIKV prME protein comprises a sequence selected from SEQ ID NOs:7-12.
28. The RNA vaccine of any one of claims 23-27, wherein the JEV signal peptide comprises the sequence of SEQ ID NO: 18.
29. The RNA vaccine of any one of claims 23-28, wherein the RNA vaccine comprises at least one modified nucleotide.
30. The RNA vaccine of any one of claims 23-28, wherein the RNA vaccine does not comprise modified nucleotides. 31. The RNA vaccine of any one of claims 23-30, wherein at least 80% of the uracil in the ORF have a chemical modification selected from N1-methyl-pseudouridine or N1-ethyl- pseudouridine, optionally wherein the chemical modification is in the 5-position of the uracil.
32. The RNA vaccine of any one of claims 23-31, wherein the RNA vaccine is formulated in a lipid nanoparticle.
33. The RNA vaccine of claim 32, wherein the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 20-60% ionizable cationic lipid, 5-25% non-cationic lipid, 25-55% sterol, and 0.5-15% PEG-modified lipid
34. The RNA vaccine of claim 33, wherein the ionizable cationic lipid comprises the following compound:
35. The RNA vaccine of any one of claims 23-34, wherein the RNA vaccine is a messenger RNA (mRNA) vaccine.
36. The RNA vaccine of any one of claims 23-25 comprising a sequence that is at least 95% identical to the sequence of SEQ ID NO:20.
37. The RNA vaccine of claim 36, wherein the sequence is at least 98% identical to the sequence of SEQ ID NO:20.
38. The RNA vaccine of claim 37, wherein the sequence comprises SEQ ID NO:20.
Abstract
Provided herein are Zika virus RNA vaccines comprising an open reading frame (ORF) encoding a Japanese Encephalitis virus (JEV) signal peptide fused to a Zika virus prME protein and methods of producing an antigen-specific immune response in a subject.